狗狗冠状危险吗？
犬冠状病毒病（Coronarivus Disease， CD)是由冠状病毒科冠状病毒属的犬冠状病毒(Canine Coronavirus ， CCV)引起的急性肠道传染病，是引起幼犬胃肠炎最常见的原因[1]。临床特征为剧烈呕吐、腹泻和厌食，病程一般为7～10d，死亡率高可达50%以上 [2-3] 。该病常呈流行性发生，多发于冬春季节及夏秋之交气候多变的时节，且发病率和病死率均随动物年龄和体质而有所不同[4]，给养宠业带来了巨大的经济和精神损失，因此，对犬冠状病毒病的防治研究具有重要意义。 目前，治疗犬冠状病毒感染的主要方法有抗菌消炎、抗病毒、提高免疫功能以及止泻等辅助治疗措施，但尚无特异性免疫治疗的方法报道，且上述治疗方法在临床上应用效果也参差不齐[5]。因此，急需开发新型安全有效的抗犬冠状病毒感染的疫苗进行免疫预防。 近年来，核酸疫苗因其无抗原耐受性风险、无需制备纯化抗原、制备工艺简单等优点成为当今疫苗开发的热点研究领域之一［6］。RNAi是一种新的基因沉默技术，是利用双链RNA诱导靶基因特异性的mRNA降解来抑制特定基因的表达过程，从而高效特异的阻止病毒复制、表达或组装［7］。基于RNAi技术的核酸疫苗具有简便易行、免疫效果好等优势已成为众多学者的研究重点。目前，核酸疫苗的研制已逐渐扩展到多种疾病领域，如禽流感、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪传染性腹泻、犬细小病毒感染等疾病［8-9］。本试验将构建CCV RNAi真核表达质粒，并对其进行了体外鉴定；然后将质粒导入小鼠成肌细胞系C2C12中，通过RT-PCR、Western blot 技术观察转染后细胞的RNA和蛋白水平的变化，旨在为CCV 的新型疫苗研究和防控提供理论依据和技术支撑。 一、材料与方法 (一）菌种、细胞株与酶类 小牛肠碱性磷酸酶(Nuclear Extracts from BovineIntestine， NEP)购自Promega公司;Triton X-100、Trizol 和DOT法试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；Taq酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂和RNA提取试剂购自Invitrogen 公司。 犬冠状病毒(CCV)标准毒株HCLV由华南农业大学牧医学院王清印教授惠赠。 鼠成纤维细胞系C2C12购自ATCC公司。
(二）主要试剂与仪器 胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素均购自Gibco公司;RIPA裂解缓冲液、BCA Protein Assay Kit和Super Signal West Direc Chemiluminescent Substrate 均购自Pierce公司;β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG抗体、ECL 检测试剂盒均为Santa Cruz Biotech公司提供。电泳仪和凝胶成像系统购自BioRad公司；冷冻高速离心机、酶标仪、低温冰箱购自Eppendorf公司；紫外分光光度计、微量移液器、微量可调移液枪和超净工作台购自Thermo Scientific 公司；PCR扩增仪、凝胶成像系统和紫外可见分光光度计购自BioRad Company ;光学显微镜和电泳槽购自Nikon公司和BioRadCompany。 (三）试验设计 C2C12细胞接种于培养瓶内，培养至80％融合时，按不同分组进行处理。实验重复3次。
二、结果与分析 采用QIAGEN 核酸提取试剂盒从CCV HCLV 病毒株中提取基因组DNA，用核酸定量仪测定其浓度和质量，OD260nm / OD280 nm 在1.7~1.9之间，符合设计要求。 2.1 合成目的片段和引物设计 根据CCV基因序列设计两条正向和反向引I物，上游引物：5'-TAGCGGATCCGAATTCTTTGTTCAAAGCGTTTG-3 '，下游引I物：5'- TCAGCTAGCATACTCAACTCAAAACAACCAAACC-3';同时设计合成一条目的RNA干扰序列和一条阴性对照序列。
2.2 重组真核表达载体的构建 以含CCV ORF全长cDNA片段的质粒pCCV3 为模板，采用PCR方法扩增目的片段，将其插入到pCMV-SPORTS3表达载体中的BamHI和Xho I两个限制性内切酶位点，构建了表达质粒pCMV-SPORT3-ORF，转化大肠杆菌DH5α后，提取质粒并进行酶切验证如图1所示。
2.3 重组质粒的鉴定 用Bam HI+ Hind III 对重组克隆质粒 pCMV-SPORTS3-ORF 进行双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察结果，结果表明，双酶切得到的目的条带大小与预期一致并且没有非特异性条带出现见图2。
2.4 表达质粒的鉴定 采用核酸扩增技术对表达载体进行荧光定量PCR扩增。反应体系总体积为25μl：2×PCR Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各1 μl